Около 1328 года родители Преподобного Сергия переселились из Ростова в Радонеж. Когда их старшие сыновья женились, Кирилл и Мария незадолго до смерти приняли схиму в Хотьковском монастыре Покрова Пресвятой Богородицы, неподалеку от Радонежа. Впоследствии овдовевший старший брат Стефан также принял иночество в этом монастыре. Похоронив родителей, Варфоломей вместе с братом Стефаном удалился для пустынножительства в лес (в 12 верстах от Радонежа). Сначала они поставили келлию, а потом небольшую церковь, и, с благословения митрополита Феогноста, она была освящена во Имя Пресвятой Троицы. Но вскоре, не выдержав трудностей жизни в пустынном месте, Стефан оставил брата и перешел в Московский Богоявленский монастырь (где сблизился с иноком Алексием, впоследствии митрополитом Московским, память 12 февраля).
Варфоломей же 7 октября 1337 года принял пострижение в монашество от игумена Митрофана с именем святого мученика Сергия (память 7 октября) и положил начало новому жительству во славу Живоначальной Троицы. Претерпевая искушения и страхования бесовские, Преподобный восходил от силы в силу. Постепенно он стал известен другим инокам, искавшим его руководства. Преподобный Сергий всех принимал с любовью, и вскоре в маленькой обители составилось братство из двенадцати иноков. Их опытный духовный наставник отличался редким трудолюбием. Своими руками он построил несколько келлий, носил воду, рубил дрова, выпекал хлеб, шил одежду, готовил пищу для братии и смиренно выполнял другие работы. Тяжелый труд Преподобный Сергий соединил с молитвой, бдением и постом. Братия удивлялась, что при таком суровом подвиге здоровье их наставника не только не ухудшалось, но еще более укреплялось. Не без труда иноки умолили Преподобного Сергия принять игуменство над обителью. В 1354 году епископ Волынский Афанасий посвятил Преподобного во иеромонаха и возвел в сан игумена. По-прежнему в обители строго выполнялись иноческие послушания. С увеличением монастыря росли и его нужды. Нередко иноки питались скудной пищей, но по молитвам Преподобного Сергия неизвестные люди приносили все необходимое.
Слава о подвигах Преподобного Сергия стала известна в Константинополе, и Патриарх Филофей прислал Преподобному крест, параман и схиму, в благословение на новые подвиги, Благословенную грамоту, советовал избраннику Божию устроить общежительный монастырь. С патриаршим посланием Преподобный отправился к святителю Алексию и получил от него совет ввести строгое общежитие. Иноки стали роптать на строгость устава, и Преподобный вынужден был покинуть обитель. На реке Киржач он основал обитель в честь Благовещения Пресвятой Богородицы. Порядок в прежней обители стал быстро приходить в упадок, и оставшиеся иноки обратились к святителю Алексию, чтобы он возвратил святого.
Преподобный Сергий беспрекословно повиновался святителю, оставив игуменом Киржачского монастыря своего ученика, преподобного Романа.
Еще при жизни Преподобный Сергий удостоился благодатного дара чудотворений. Он воскресил отрока, когда отчаявшийся отец считал единственного сына навсегда потерянным. Слава о чудесах, совершенных Преподобным Сергием, стала быстро распространяться, и к нему начали приводить больных как из окрестных селений, так и из отдаленных мест. И никто не покидал Преподобного, не получив исцелений недугов и назидательных советов. Все прославляли Преподобного Сергия и благоговейно почитали наравне с древними святыми отцами. Но людская слава не прельщала великого подвижника, и он по-прежнему оставался образцом иноческого смирения.
Однажды святитель Стефан, епископ Пермский (память 27 апреля), глубоко почитавший Преподобного, направлялся из своей епархии в Москву. Дорога пролегала в восьми верстах от Сергиева монастыря. Предполагая посетить монастырь на обратном пути, святитель остановился и, прочитав молитву, поклонился Преподобному Сергию со словами: «Мир тебе, духовный брат». В это время Преподобный Сергий сидел вместе с братией за трапезой. В ответ на благословение святителя Преподобный Сергий встал, прочитал молитву и послал ответное благословение святителю. Некоторые из учеников, удивленные необычайным поступком Преподобного, поспешили к указанному месту и, догнав святителя, убедились в истинности видения.
Постепенно иноки становились свидетелями и других подобных явлений. Однажды во время литургии Преподобному сослужил Ангел Господень, но по смирению своему Преподобный Сергий запретил кому-либо рассказывать об этом до конца его жизни на земле.
Тесные узы духовной дружбы и братской любви связывали Преподобного Сергия со святителем Алексием. Святитель на склоне лет призвал к себе Преподобного и просил принять Русскую митрополию, но блаженный Сергий по смирению отказался от первосвятительства.
Русская земля в то время страдала от татарского ига. Великий князь Димитрий Иоаннович Донской, собрав войско, пришел в обитель Преподобного Сергия испросить благословения на предстоявшее сражение. В помощь великому князю Преподобный благословил двух иноков своей обители: схимонаха Андрея (Ослябю) и схимонаха Александра (Пересвета), и предсказал победу князю Димитрию. Пророчество Преподобного Сергия исполнилось: 8 сентября 1380 года, в день праздника Рождества Пресвятой Богородицы, русские воины одержали полную победу над татарскими полчищами на Куликовом поле, положив начало освобождения Русской земли от татарского ига. Во время сражения Преподобный Сергий вместе с братией стоял на молитве и просил Бога о даровании победы русскому воинству.
За ангельскую жизнь Преподобный Сергий удостоился от Бога небесного видения. Однажды ночью авва Сергий читал правило перед иконой Пресвятой Богородицы. Окончив чтение канона Божией Матери, он присел отдохнуть, но вдруг сказал своему ученику, преподобному Михею (память 6 мая), что их ожидает чудесное посещение. Через мгновение явилась Божия Матерь в сопровождении святых апостолов Петра и Иоанна Богослова. От необыкновенно яркого света Преподобный Сергий пал ниц, но Пресвятая Богородица прикоснулась к нему руками и, благословляя, обещала всегда покровительствовать святой обители его.
Достигнув глубокой старости, Преподобный, за полгода прозрев свою кончину, призвал к себе братию и благословил на игуменство опытного в духовной жизни и послушании ученика, преподобного Никона (память 17 ноября). В безмолвном уединении Преподобный преставился к Богу 25 сентября 1392 года. Накануне великий угодник Божий в последний раз призвал братию и обратился со словами завещания: «Внимайте себе, братие. Прежде имейте страх Божий, чистоту душевную и любовь нелицемерную…»